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    公司对葡萄糖-6-磷酸酶染色液(铅法)操作方法

    发布时间: 2015-01-12  点击次数: 1902次

    产品简介:
    葡萄糖-6-磷酸酶染色液是一种多存在于哺乳类动物肝、肾、肠等组织的膜结合酶,G-6-Pase 和微体紧密结合,定位于内质网,是内质网的主要标志酶,能把葡萄糖-6-磷酸水解成葡萄糖和磷酸。G-6-Pase 对维持血糖浓度的相对恒定有至关重要的作用,是糖代谢的关键酶。当血糖降低时,G-6-Pase 促进肝糖原转变为血糖。当缺乏G-6-Pase 时,会引起糖原分解障碍,使糖原积累在肝、肾、心脏等部位,导致肝糖原储积病。G-6-Pase zui适pH 为6.5,在pH6.0~8.0 亦可,pH8.0 zui稳定,pH5.0易变性。组织化学反应多用pH6.5~6.7。
    葡萄糖-6-磷酸酶染色液(铅法)采用重金属捕捉剂和磷酸结合显示酶的活性。该酶对固定很敏感,组织经80%乙酸溶液固定后用石蜡包埋,G-6-Pase *被抑制。需用新鲜组织低温恒冷切片,经甲醛短时固定酶即失活,但可短时低温丙酮固定,但一般不固定。
    操作步骤(仅供参考):
    1、冰冻切片入蒸馏水清洗。
    2、入G-6-Pase 孵育液,37℃孵育15~20min。
    3、自来水冲洗后,蒸馏水冲洗。
    4、在上述过程中配制ALP 硫化工作液,即取试剂(B)用蒸馏水稀释50 倍, 即为ALP 硫化工作液,即配即用。切片入硫化工作液,孵育1min。
    5、自来水水洗3~5min。
    6、(可选)入中性福尔马林,固定2min。
    7、入蒸馏水水洗2 次。
    8、甘油明胶封片

    铅法:葡萄糖-6-磷酸水解后所释放出磷酸,为*所捕获,经硫化铵处理,zui终反应产物为颗粒状的硫化铅沉淀。反应通式如下:
     
    葡萄糖―6―磷酸钠+H2 O 葡萄糖 -6- 磷酸酶 葡萄糖+磷酸 Pb(NO3 )2 Pb3 (PO4 )2  (NH4 )2 S PbS↓
     
     1)孵育液配制(新鲜配制)
      0.125%葡萄糖―6―磷酸钠                       4ml
      0.2mol/LTris-顺丁烯二酸盐缓冲液(pH 7.4)       4ml
      2%Ph(N03 )2 (2.5%)                              0.6ml
      蒸馏水                                          1.4ml
      充分混合后使用
     
        2)染色程序:
        ①新鲜组织冰冻切片;
        ②10%福尔马林固定5分钟后水洗;
        ③切片入孵育液中,37℃孵育20分钟水洗;
        ④人1%硫化铵水溶液中1分钟水冲洗;
        ⑤3%福尔马林后固定10分钟;
        ⑥甘油明胶封固。
     
        3)结果:酶活性处显棕色。
     
        4)对照实验:①除去底物;②以F―甘油磷酸钠代替底物;③以0.01mol/L氟化钠作为抑制剂。

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