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ELISA试剂盒具有活络、特异、简略、快速、安稳及易于自动化操作等特征。不只适用于临床标本的检查,而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此,也适合于血清盛行病学查询。ELISA法是免疫确诊中的一项新技术,现已成功地运用于多种病原微生物所引起的盛行症、寄生虫病及非盛行症等方面的免疫确诊。也已运用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定,根据现已运用的效果,本法不只可以用来测定抗体,而且也可用于测定体液中的循环抗原,所以也是一种前期确诊的出色办法。因此ELISA试剂盒在生物医学各领域的运用规划日益扩大,可归纳四个方面:
1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。
2、研究抗酶抗体的组成。
3、闪现微量的免疫沉淀反应。
4、定量检测体液中抗原或抗体成份。
操作流程如下:
(1)待测样品孔中每孔参与待测样品100μl,每种样品设3个平行孔;设两个阴性对照孔,每孔加未处理组的细胞裂解液100μl;另设一个空白对照孔,参与纯细胞裂解液100μl。
(2)酶标板置4℃,包被过一夜。
(3)洗板:吸干孔内反应液,用洗刷液过洗一遍(将洗刷液注满板孔后,即甩去),之后将洗刷液注满板孔,浸泡1-2分钟,间歇摇晃。甩去孔内液体后在吸水纸上拍干。重复洗刷3-4次。
(4)阴性对照孔每孔参与PBS 50μl,样品孔及空白孔每孔参与1:500稀释的兔抗人AIF抗体工作液50μl。
(5)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。
(6)洗板,同(4)。
(7)每孔加1:5000稀释的HRP-符号的山羊抗兔抗体工作液 100μl。
(8)酶标板置37℃培养箱的湿盒内,孵育60min。
(9)洗板,同(4)。
(10)每孔加TMB显色液 100μl,悄然混匀10s,置37℃暗处反应15-20min。
(11)每孔加100μl 2mol/L H2SO4停止反应。
(12)分别测450nm 吸光值W1和630nm吸光值W2,终究测得的OD值为两者之差(W1-W2),以削减由容器上的划痕或指印等构成的光烦扰。
(13)数据处理:在得出标本(S)和阴性对照(N)的 OD值后,核算S/N值。S/N≥2.1为阳性断定标准。
注:所用溶液配方
(1) PBS:称取0.2g KH2P04, 2.9g Na2HP04?12H20、8.0g NaCl, 0.2g KCl,加双蒸水至1000ml。
(2)包被缓冲液:称取1.59g Na2CO3, 2.938 NaHCO3,加双蒸水至 1000m1。
(3)洗刷液(PBST):含0.05% Tween-20的PBS。
(4)稀释液:含0.1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS,首要用以稀释抗体、标准品、样品。
(5)TMB显色液:称取1.84g Na2HP04.12H20, 0.51 g柠檬酸,加双蒸水至1O0ml,配成柠檬酸-磷酸缓冲溶液。用10.5 ml 柠檬酸-磷酸缓冲溶液溶解1锭TMB,再参与35μl 3% H2O2
(6)ELISA试剂盒细胞裂解液:1% TritonX-100,137mmol/L NaCl,20mmol/L Tris-HCl,2mmol/L EDTA,1mmol/L PMSF,pH 7.4。(其间PMSF溶于异丙醇中,配成1O mmo/L,-20℃ 储存备用。