ELISA试剂盒优异的试剂，杰出的仪器和准确的操作是确保ELISA查看成果准确牢靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的构成不一样而有所区别，国内医学查验通常均用板式。本文将叙说板式ELISA各个操作进程的留意关键（珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特别仪器合作运用，两者均有详细的运用阐明，须严厉遵循规程操作）。
标本的采纳和保留
通常咱们可用于ELISA查看的样本是有多种类型的，如血清、血浆、尿液、细胞培育上清或安排匀浆液等，不一样类型的查看样本前期的处理办法是不一样的。准确的处理样本是确保ELISA查看的准确性和准确性的*步，下面简略介绍一下不一样类型的样本的处理办法。
血清
血清是zui常用于ELISA查看的一类样本，处理也比较简略。
用无热原、无内毒素的试管或离心管搜集血液标本，将试管或离心管室温放置2小时或4℃，使血清分出。（将试管或离心管歪斜放置，使液面横截面增大，能使血清更大程度的分出。）4℃1000×g离心20min，细心搜集上清。主张将血清分装多份，-20℃或-80℃保留，防止重复冻融。采血进程中应防止溶血，由于红细胞裂解时会开释具有过氧化酶活性的物质，在以HRP为符号的ELISA查看中会有非特异性的显色，而致使查看的不准确性。一起也应防止细菌污染，由于菌体内也许富含内源性的HRP然后致使查看的假阳性。
血浆
ELISA试剂盒用含抗凝剂的采血管或离心管搜集血液标本，标本搜集后30min内4℃1000×g离心15min，取上清即血浆。将上清分装多份，-20℃或-80℃保留，防止重复冻融。防止运用溶血或高血脂的标本。
常用的抗凝剂为EDTA、肝素钠和枸橼酸钠等，查看时还应细心阅览试剂盒阐明书，查看试剂盒是不是对抗凝剂有特别请求。
细胞培育上清
取细胞培育上清到离心管，1000×g离心20min，除掉细胞碎片及杂质，取上清，-20℃或-80℃保留，防止重复冻融。 
细胞裂解液
1) 吸去培育板内的培育基，用胰酶消化细胞，加恰当培育基将细胞从培育板上吹下来。悬浮细胞可省略。
2) 搜集细胞悬液，1000×g离心10min，弃去培育基，用预冷的PBS润洗3次。
3) 参加恰当的预冷PBS或细胞裂解液（临用前参加蛋白酶按捺剂）重悬细胞。通常6孔板一个孔的细胞量需求150~250μL PBS重悬。
4) 将样品放入-20℃或-80℃，使样品冷冻，再放室温冻结样品，重复冻融几回，使细胞充沛裂解。也可将样品进行超声破碎，以到达裂解的意图。
5) 4℃10000×g 离心10min，除掉细胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保留，防止重复冻融。
安排匀浆液
1) 将安排样本用PBS (0.01M, PH 7.4) 冲刷，洗去安排外表残留的血液或杂质。
2) 将安排块称重，记载后剪碎，碎块应尽量小，便于匀浆得更充沛。
3) 将安排按必定的份额参加预冷的PBS（临用前参加蛋白酶按捺剂）匀浆，匀浆时置于冰上或冰浴中。（通常按安排分量：PBS体积=1:9的份额匀浆，例如1g的安排样本对应9mL的PBS，详细体积可依据试验需求恰当调整，查看后核算样品浓度时应乘以相应的稀释倍数）。
4) 汲取匀浆液到离心管，4℃5000×g 离心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保留，防止重复冻融。尿液、唾液等别的液体生物样本
1000×g离心20min，取上清即可查看。
总的来说，由于ELISA只能查看可溶性蛋白的含量，所以应确保一切样本均为弄清的液体，沉积或悬浮物都应离心去掉。
为了确保查看的准确性，保留于-20℃或-80℃的样本在1~6个月内查看；4℃保留的样本应在1周内进行查看。
别的，还应确保样本不含NaN3，由于NaN3会按捺HRP的活性，然后致使假阴性的成果。
试剂的预备
按试剂盒阐明书的请求预备试验中需用的试剂。ELISA顶用的蒸馏水或去离子水，包含用于洗刷的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液、洗刷液运用pH计丈量。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后运用，通常室温平衡不低于30min。试剂盒中本次试验不需用的有些应及时放回冰箱保留
加样
在ELISA中通常有3次加样步聚，即加标本，加酶物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，防止加在孔壁上部，并留意不行溅起，不行发作气泡。
加标本通常用微量加样器，按规则的量参加板孔中。每次加标本应更换吸嘴，防止发作穿插污染，也可用一次性的定量塑料管加样（通常不主张运用）。有些目标查看（如间接法ELISA）需用稀释的血清，可在试管中按规则的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中参加稀释液，再在其间参加血清标本，然后在微型震动器上震动1min。加酶物工作液和底物工作液时可用多道移液器，使加液进程在zui短时刻内完结。
保温
在ELISA中通常有两次抗原抗体反响，即加标本和加酶物后。抗原抗体反响的完结需求有必定的温度和时刻，这一保温进程称为温育(incubation)，有人称之为孵育。
ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的只在固相外表上发作。以抗体包被的夹心法为例，参加板孔中的标本，其间的抗原并不是都有均等的和固相抗的时机，只要zui靠近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体触摸。这是一个逐步平衡的进程，因而需经分散才干到达反响的结尾。在这以后参加的酶符号抗体与固相抗原的也一样如此。这即是为何ELISA反响总是需求必定时刻的温育。
温育常选用的温度有43℃、37℃、室温文4℃（冰箱温度）等。37℃是试验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体的适宜温度。在建立ELISA办法作反响动力学研讨时，两次抗原抗体反响通常在37℃经1-2小时，产品的生成可达高峰。为加快反响，可进步反响的温度，有些试验在43℃进行，但不宜选用更高的温度?？乖固宸聪?℃更为*，在放射免疫测定中多使反响在冰箱中，以构成zui多的沉积。但因所需时刻太长，在ELISA中通常不予选用。 
保温的办法除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，通常均选用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度敏捷平衡。为防止蒸腾，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此刻可让反响板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性杰出的资料如金属等，在盒底垫湿的纱布，终究将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规则的温度，特别是在气温较低的时分更应如此。为防止酶标板底部受水汽或磨损致使的读数差错，通常选用鼓风恒温箱保温，这个进程有必要在酶标板上方贴封纸，防止蒸腾。无论是水浴仍是湿盒温育，反响板均不宜叠放，以确保各板的温度都能敏捷平衡。室温温育的反响，操作时的室温应严厉约束在规则的规模内，规范室温温度是指20-25℃，但详细操作时可依据阐明书的请求操控温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应留意温育的温度和时刻应按规则力求准确。为确保时刻准确，一个人一次不宜多于两块板一起操作、测定。
洗刷
洗刷在ELISA进程中虽不是一个反响进程，但却也决议着试验的成败。ELSIA即是靠洗刷来到达别离游离的和的酶符号物的意图。经过洗刷以铲除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体的物质，以及在反响进程中非特异性地吸附于固相载体的搅扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗刷时又应把这种非特异性吸附的搅扰物质洗刷下来。能够说在ELISA操作中，洗刷是zui首要的关键技术，应引起操作者的高度重视，操作者应严厉按请求洗刷，不得大意。
洗刷的办法除某些ELISA仪器配有特别的主动洗刷仪外，手工操作有浸泡式和流水冲刷式两种，进程如下：
（1）浸泡式：a.吸干或甩干孔内反响液；b.用洗刷液过洗一遍（将洗刷液注满板孔后，即甩去）；c.浸泡，行将洗刷液注满板孔，放置1-2min，间歇摇摆，浸泡时刻不行随意缩短；d.吸干孔内液体。吸干应*，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液体后在清洁毛巾或吸水纸上拍干；e.重复操作c和d，洗刷3-4次（按阐明规则）。在间接法中如本底较高，可增加洗刷次数或延伸浸泡时刻。
微量滴定板多选用浸泡式洗刷法。洗刷液多为含非离子型洗刷剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的是疏水性的，非离子型洗刷剂既含疏水基团，也含亲水基团，其疏水基团与蛋白质的疏水基团借疏水键，然后削弱蛋白质与固相载体的，并借助于亲水基团和水分子的效果，使蛋白质回复到水溶液情况，然后脱离固相载体。洗刷液中的非离子型洗刷剂通常是吐温20，其浓度可在0.05%-0.2%之间，高于0.2%时，可使包被在固相上的抗原或抗体解吸附而减低试验的灵敏度。
（2）流水冲刷式：流水冲刷法开始用于小珠载体的洗刷，洗刷液仅为蒸馏水乃至可用自来水。洗刷时附接一特别设备，使小珠在流水冲击下不断地翻滚淋洗，持续冲刷2min后，吸干液体，再用蒸馏水浸泡2min，吸干即可。浸泡式犹如盆浴，流水冲刷式则比方淋浴，其洗刷效果更为*，且也简洁、迅速。已有试验标明，流水冲刷式一样也适用于微量滴定板的洗刷。洗刷时设法加大水流量或加大水压，让水流冲击板孔外表，洗刷效果更佳（此办法试剂盒较少选用）。
显色和比色
显色
显色是ELISA中的终究一步温育反响，此刻酶催化无色的底物生成有色的产品。反响的温度和时刻仍是影响显色的要素。在必定时刻内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时刻的延伸而呈色加强。恰当进步温度有助于加快显色进行。在定量测定中，参加底物后的反响温度和时刻应按规则力求准确。定性测定的显色可在室温进行，时刻通常不需求严厉操控，有时可依据阳性对照孔和阴性对照孔的显**况恰当缩短或延伸反响时刻，及时判别。
OPD底物显色通常在室外温或37℃反响20-30min后即不再加深，再延伸反响时刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反响应避光进行，显色反响结束时参加停止液停止反响。OPD产品用硫酸停止后，显色由橙转向棕。
TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反响调查成果。但为确保试验成果的稳定性，宜在规则的恰当时刻阅览成果。TMB经HRP效果后，约40min显色达高峰，随即逐步减弱，至2小时后即可*衰退至无色。TMB的停止液有多种，叠氮钠和十二烷基硫酸钠（SDS）等酶按捺剂均可使反响停止。这类停止剂尚能使蓝色保持较长时刻（12-24小时）不褪，是目视判别的杰出停止剂。此外，各类酸性停止液则会使蓝色转变成，此刻可用特定的波长（450nm）测读吸光值。
比色
比色前应先用洁净的吸水纸拭干板底附着的液体，但应尽量防止刮花外表，然后将板准确放入酶标比色仪的比色架中。以软板为载体的试验，需先将板置于规范96孔的座架中，才可进行比色。在加底物液显色前，先将软板边际剪净，这么，此板就可*平妥坐入座架中。
比色时应先以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反响仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液替代标本作全进程的孔），以记载本次试验的试剂情况。这以后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行核算。
比色成果的表达以往通用光密度（oplical density，OD），现按规则用吸光度（absorbence，A），两者含义一样。通常的表明办法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，表明办法为"A492nm"或"OD492nm"。
酶标比色仪
酶标比色仪简称酶标仪，通常指于测读ELISA成果吸光度的光度计。针对固相载体方式的不一样，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。很多试剂公司配套供给酶标仪。酶标仪的首要功能目标有：测读速度、读数的准确性、重复性、准确度和可测规模、线性等等。的酶标仪的读数通?？勺既返?.0 01，准确性为±1%，重复性达0.5%。举例说，若某孔测得的A值为1.083，则该孔相对于空气的真实A值应为1.083± 0.01(1.073~1.093），重复测定数次，其A值均应1.083±0.05（1.078~1.088）在之间。酶标仪的可测规模视各酶标仪的功能而不一样。普通的酶标仪在0.000~2.000，新类型的酶标仪上限拓展达2.900，乃至更高。超出可测上限的A值常以"*"或"over"或其它符号表明。应留意可测规模与线性规模的不一样，线性规模常小于可测规模，比方某一酶标仪的可测规模为0.000~2.900，而其线性规模仅0.000~2.000，这在定量ELISA中制造规范曲线时应予留意。
ELISA试剂盒酶标仪不该安顿在阳光或强光照射下，操作时室温宜在15~30℃，运用前先预热仪器15-30min，测读成果更稳定（也有一些酶标仪阐明书上明晰标明不需求预热）。
测读A值时，要选用产品的灵敏吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读，即每孔先后测读两次，在zui适波长（W1），第2次在不灵敏波长（W2），两次测定间不移动ELISA板的方位。例如OPD用492nm为W1，630nm为W 2，终究测得的A值为两者之差（W1-W2）。双波长式测读可削减由容器上的划痕或指印等形成的光搅扰。
各种酶标仪功能有所不一样，运用中应详细阅览阐明书。
成果判别
定性测定